MetRS Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402763-ACT

O gene humano MARS codifica a metionil‑tRNA sintetase (MetRS), uma aminoacil‑tRNA sintetase de classe I que liga metionina aos tRNA^Met iniciador e elongador, estabelecendo a iniciação da tradução e sustentando a síntese global de proteínas. A atividade da MetRS conecta a disponibilidade de aminoácidos à produtividade dos ribossomos e à proteostase, influenciando respostas ao estresse, como a resposta integrada ao estresse, e a sinalização de nutrientes ligada ao mTOR, por meio do seu impacto na capacidade de tradução. Como componente central da maquinaria de tradução citosólica, alterações na expressão ou na função de MARS podem perturbar programas de crescimento celular, a homeostase mitocondrial e do retículo endoplasmático (RE) via desequilíbrio do proteoma, e respostas adaptativas à limitação de aminoácidos. A desregulação de fatores relacionados à tradução, incluindo as aminoacil‑tRNA sintetases, é frequentemente estudada no contexto de fenótipos do neurodesenvolvimento, da aptidão de células cancerosas e da sinalização inflamatória, em que o controle translacional molda o estado celular.

MetRS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MARS sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MetRS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MARS em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MARS, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MetRS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MARS nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MetRS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MetRS em células tumorais com expressão de MARS silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.