MCH-1R Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402512-ACT

MCHR1 codifica o receptor 1 do hormônio concentrador de melanina (MCH-1R), um GPCR de classe A que se liga ao MCH para modular a sinalização neuronal envolvida na homeostase energética, no comportamento alimentar e na regulação neuroendócrina. Após a ativação, o MCH-1R acopla-se principalmente a proteínas G para influenciar vias de sinalização de segundos mensageiros, incluindo as dependentes de cAMP e de cálcio, e também pode envolver a sinalização MAPK/ERK para moldar respostas transcricionais a jusante. A expressão de MCHR1 em circuitos hipotalâmicos e límbicos associa esse receptor à regulação do apetite, do estado de vigília e de comportamentos responsivos ao estresse. A sinalização desregulada do MCH-1R tem sido estudada no contexto de obesidade e desequilíbrio metabólico, bem como em fenótipos neuropsiquiátricos, nos quais uma alteração do tônus neuromodulatório pode contribuir para mudanças nos circuitos associadas à doença.

MCH-1R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MCHR1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MCH-1R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MCHR1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MCHR1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MCH-1R. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MCHR1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MCH-1R no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MCH-1R em células tumorais com expressão de MCHR1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.