MARCH5 CRISPR/Cas9 KOプラスミド (h): sc-404655

概要

MARCH5（membrane associated RING-CH-type finger 5）は、ミトコンドリア外膜に局在するRING型E3ユビキチンリガーゼをコードしており、ミトコンドリアにおけるタンパク質品質管理とダイナミクスを制御します。DRP1やミトフュージンなど、ミトコンドリアの分裂・融合装置の主要構成因子をユビキチン化することで、MARCH5はミトコンドリア形態、マイトファジー、アポトーシスシグナル伝達の協調に寄与します。その活性は、ユビキチン依存的なプロテオスタシスを、酸化的リン酸化（OXPHOS）の健全性や細胞ストレス応答と結び付けます。MARCH5機能の破綻は、神経変性やがんに関連する代謝リモデリングにおけるミトコンドリア恒常性の変化と関連づけられており、ミトコンドリアシグナル伝達経路の機序研究において重要です。

MARCH5 CRISPR/Cas9 KOプラスミド（h）は、human細胞株におけるMARCH5遺伝子の標的破壊のために設計されたプラスミドのプールです。このプールに含まれる各プラスミドは、Streptococcus pyogenes Cas9 ヌクレアーゼとともに、MARCH5 遺伝子座内の異なる部位を標的とする固有の sgRNA を共発現し、蛍光による同定と、トランスフェクションに成功した細胞の濃縮を可能にする GFP をコードしています。このマルチガイド戦略は、機能的なノックアウトをもたらすフレームシフトや欠失を誘導する可能性を高め、シングルガイドアプローチに代わる、より堅牢な選択肢を提供します。複数の部位で誘導された二本鎖切断（DSB）は、非相同末端結合（NHEJ）によって修復されるか、または同梱のHDRドナーテンプレートと併用した場合、遺伝子座内の定義された標的部位で相同性依存修復（HDR）によって修復されます。

RFP発現HDRドナーと併用する場合、GFPとRFPの蛍光を併用して、トランスフェクトされた細胞集団と編集された細胞集団を区別できるため、フローサイトメトリーに基づく選別およびクローン選択のワークフローが効率化されます。

相同性依存修復（HDR）ドナー — RFPレポーター付きプロマイシンカセット

確認済みで選択可能なノックアウトクローンを必要とする用途向けに、MARCH5 HDRプラスミド（h）には、定義されたMARCH5ターゲット部位に特異的なホモロジーアームに挟まれた、プロマイシン耐性カセット（PuroR）および赤色蛍光タンパク質（RFP）レポーターを含むHDRドナー構築体が含まれています。
MARCH5 CRISPR/Cas9 KOプラスミド（h）と共トランスフェクションした場合：

• PuroR-RFPカセットはHDRを介してCas9切断部位に組み込まれ、MARCH5のオープンリーディングフレームを破壊します。
  RFP蛍光は、組み込みの成功を即座に視覚的に示す指標となり、プテロマイシン選別前または選別と並行して、蛍光に基づく編集細胞の同定や選別を可能にします。
  編集に成功した細胞はプテロマイシン耐性によって確認されるため、クローンスクリーニングの負担を大幅に軽減します。
  この選別戦略は、下流の機能解析、薬剤スクリーニング、またはモデル開発のための安定したクローン性KO細胞株の作製に最適です。

Cre-loxカセット除去システム

このHDRドナー構築体には、PuroR-RFP選択カセットを挟むloxPサイトが組み込まれており、クローンの確認後にマーカーをきれいに除去することが可能です。同梱のCreベクター：sc-418923によるCreリコンビナーゼの一過性発現により、カセットが切除され、MARCH5遺伝子座内に最小限の残留loxPサイトが残るだけで、下流のアッセイに対する潜在的な交絡効果が排除されます。
この2段階のアプローチ：

• 局所的なクロマチン構造および近隣の調節要素への影響を最小限に抑えます
  編集された遺伝子座において、ほぼ天然の状態に近いゲノム環境を回復させます
  同じ細胞株において、さらなる編集のためにプロマイシン選別戦略を再利用可能にします

主な特徴

• MARCH5の機能に不可欠なMARCH5エクソンを標的とするgRNA
  デリバリーを簡素化するため、SpCas9とsgRNAを単一のプラスミドから共発現
  陽性クローン選別用のプロマイシン耐性HDRドナー
  シームレスなマーカー除去のためのCreリコンビナーゼベクターを備えたloxPで挟まれたPuroRカセット
  トランスフェクションによる導入用に即使用可能な状態で提供

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。