LYPD8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-418674-ACT

LYPD8 (Ly6/PLAUR domain containing 8) codifica uma proteína secretada da família Ly6, associada a glicofosfatidilinositol (GPI), enriquecida nas superfícies mucosas, onde contribui para a homeostase da barreira epitelial e para as interações hospedeiro–microrganismo. No trato gastrointestinal, o LYPD8 está implicado na limitação do acesso bacteriano à camada epitelial ao modular a motilidade microbiana e a organização espacial dentro do muco, moldando assim o tônus imunitário inato. Por meio desses processos associados à barreira, o LYPD8 se cruza com vias que regulam a defesa mucosa, a inflamação e a sinalização dependente do microbioma. Alterações na expressão ou na função de LYPD8 têm sido associadas a estados inflamatórios intestinais e a respostas de estresse epitelial, reforçando sua relevância em modelos de colite, disbiose e disfunção de barreira.

LYPD8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LYPD8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LYPD8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LYPD8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LYPD8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LYPD8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LYPD8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LYPD8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LYPD8 em células tumorais com expressão de LYPD8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.