LIMP II Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402532-ACT

SCARB2 codifica a proteína integral de membrana lisossomal 2 (LIMP II), uma glicoproteína de membrana do tipo III enriquecida em endossomos tardios e lisossomos, que sustenta a maturação das organelas, o tráfego de membranas e a homeostase lisossomal. A LIMP II é necessária para a entrega e a função adequadas de hidrolases lisossomais, incluindo seu papel bem caracterizado como receptor no transporte da glicocerebrosidase para os lisossomos. Por meio dessas atividades, o SCARB2 influencia a dinâmica endolisossomal, o fluxo da via autofagia–lisossomo e as respostas celulares ao estresse proteostático e do metabolismo lipídico. Assim, a desregulação de SCARB2/LIMP II é relevante para estudos de fenótipos de armazenamento lisossomal, vias associadas à neurodegeneração e interações hospedeiro–patógeno que dependem da entrada endocítica e da função lisossomal.

LIMP II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SCARB2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LIMP II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SCARB2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SCARB2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LIMP II. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SCARB2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LIMP II no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LIMP II em células tumorais com expressão de SCARB2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.