KIR6.1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401477-ACT

KCNJ8 codifica a subunidade do canal de potássio retificador para dentro KIR6.1, um componente central dos canais de potássio sensíveis ao ATP (KATP), que acoplam o estado metabólico celular à excitabilidade da membrana. Em complexo com subunidades do recetor de sulfonilureias (ABCC8/ABCC9), a KIR6.1 regula o efluxo de potássio em resposta às razões intracelulares ATP/ADP, moldando o potencial de membrana, a entrada de cálcio e a sinalização a jusante que controla o tónus vascular e a contratilidade do músculo liso. Estes canais são parte integrante de vias de deteção metabólica e de resposta ao stress em tecidos excitáveis e não excitáveis, influenciando a função mitocondrial e a bioenergética celular. Alterações na atividade de KCNJ8/KIR6.1 têm sido associadas a fenótipos cardiovasculares e relacionados com a excitabilidade, sustentando a sua relevância em estudos de canalopatias e dos mecanismos de doenças cardiometabólicas.

KIR6.1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KCNJ8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KIR6.1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KCNJ8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KCNJ8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KIR6.1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KCNJ8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KIR6.1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KIR6.1 em células tumorais com expressão de KCNJ8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.