KCC3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405975-ACT

SLC12A6 codifica o cotransportador de potássio–cloreto KCC3, um membro da família de cotransportadores cátion-cloreto que medeia o efluxo eletroneutro de K+ e Cl− para regular o cloreto intracelular, o equilíbrio osmótico e o volume celular. A atividade do KCC3 contribui para a manutenção do potencial de membrana e da excitabilidade neuronal ao moldar gradientes de cloreto que influenciam a neurotransmissão inibitória, e é modulada por vias de sinalização dependentes de fosforilação, responsivas ao estresse celular e à homeostase iônica. No sistema nervoso, o KCC3 sustenta a integridade dos axônios e da mielina e participa das respostas a edema e a perturbações iônicas. A disrupção genética ou a desregulação de SLC12A6 está associada a fenótipos do neurodesenvolvimento e neurodegenerativos, incluindo neuropatia periférica e anormalidades da substância branca, tornando-o relevante para o estudo de mecanismos de transporte iônico em tipos celulares pertinentes à doença.

KCC3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC12A6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KCC3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC12A6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC12A6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KCC3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC12A6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KCC3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KCC3 em células tumorais com expressão de SLC12A6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.