INSR/Insulin Receptor Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400075-ACT

INSR codifica il recettore dell’insulina, una tirosin-chinasi recettoriale transmembrana che lega l’insulina per avviare l’autofosforilazione e la segnalazione a valle attraverso le vie PI3K–AKT e RAS–MAPK. Queste cascate coordinano l’assorbimento del glucosio, la sintesi di glicogeno, il metabolismo lipidico e, più in generale, il controllo della crescita e della sopravvivenza cellulare, con interazioni reciproche (cross-talk) con mTOR e con programmi trascrizionali regolati da FOXO. L’attività di INSR modula le dinamiche di endocitosi e riciclo del recettore e influenza la sensibilità all’insulina a livello di proteine adattatrici come i membri della famiglia IRS. La disregolazione della segnalazione di INSR è fortemente associata all’insulino-resistenza e alla biologia delle malattie metaboliche ed è rilevante anche per l’alterata segnalazione della crescita osservata in molteplici tessuti e nei microambienti tumorali.

INSR/Insulin Receptor Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di INSR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

INSR/Insulin Receptor Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus INSR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione INSR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di INSR/Insulin Receptor. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus INSR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da INSR/Insulin Receptor nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via INSR/Insulin Receptor nelle cellule tumorali con espressione di INSR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.