INSR/Insulin Receptor CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400075-ACT

INSR kodiert den Insulinrezeptor, eine transmembranäre Rezeptor-Tyrosinkinase, die Insulin bindet und dadurch Autophosphorylierung sowie nachgeschaltete Signalübertragung über die PI3K–AKT- und RAS–MAPK-Signalwege auslöst. Diese Kaskaden koordinieren die Glukoseaufnahme, die Glykogensynthese, den Lipidstoffwechsel und darüber hinaus die Regulation von Zellwachstum und -überleben, mit Crosstalk zu mTOR- und FOXO-regulierten Transkriptionsprogrammen. Die INSR-Aktivität beeinflusst zudem die Dynamik von Rezeptor-Endozytose und -Recycling und wirkt sich auf die Insulinsensitivität auf Ebene von Adapterproteinen wie Mitgliedern der IRS-Familie aus. Eine Dysregulation der INSR-Signalübertragung ist eng mit Insulinresistenz und der Biologie metabolischer Erkrankungen verknüpft und ist auch für veränderte Wachstumssignale relevant, wie sie in verschiedenen Geweben und Tumormikroumgebungen beobachtet werden.

INSR/Insulin Receptor Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen INSR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

INSR/Insulin Receptor Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des INSR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der INSR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen INSR/Insulin Receptor-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native INSR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von INSR/Insulin Receptor-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des INSR/Insulin Receptor-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem INSR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.