HSP 40-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403819-ACT

DNAJA1 codifica il co-chaperone umano HSP 40-4 (omologo di Hsp40/DnaJ), una proteina con dominio J che stimola l’attività ATPasica di HSPA/Hsp70 per favorire il ripiegamento, il ripiegamento corretto e lo smistamento delle proteine client durante lo stress della proteostasi. Coordinandosi con Hsp70 e con altre reti di chaperoni, HSP 40-4 contribuisce al controllo di qualità proteico, alla gestione delle proteine mal ripiegate e alle risposte cellulari allo shock termico e allo stress ossidativo, con collegamenti funzionali alle vie ubiquitina–proteasoma e dell’autofagia. Un’alterata capacità di chaperoni e uno squilibrio della proteostasi sono implicati nella tolleranza allo stress delle cellule tumorali e nelle patologie da misfolding proteico, rendendo DNAJA1 un nodo utile per studiare i meccanismi di adattamento allo stress e la regolazione, dipendente dagli chaperoni, delle proteine di segnalazione.

HSP 40-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DNAJA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSP 40-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DNAJA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DNAJA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSP 40-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DNAJA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSP 40-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSP 40-4 nelle cellule tumorali con espressione di DNAJA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.