hnRNP A1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420895-ACT

Mouse Hnrnpa1 codifica hnRNP A1, un’abbondante proteina legante l’RNA che si associa ai pre-mRNA per coordinare lo splicing alternativo, l’esportazione dell’mRNA, la stabilità e la traduzione. hnRNP A1 inoltre fa la spola tra nucleo e citoplasma e contribuisce alla dinamica dei granuli di stress e al controllo qualità dell’RNA, collegando l’elaborazione dell’RNA alle risposte cellulari allo stress. Attraverso un’ampia regolazione del trascrittoma, hnRNP A1 influenza vie quali la funzione dello spliceosoma, le risposte al danno del DNA e i programmi di segnalazione legati alla crescita. La disregolazione dell’espressione o della localizzazione di hnRNP A1 è stata associata a pattern di splicing alterati e a un metabolismo dell’RNA perturbato, rilevanti per la neurodegenerazione e la biologia dei tumori, rendendola un nodo ampiamente utilizzato per studi meccanicistici della regolazione post-trascrizionale.

hnRNP A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hnrnpa1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

hnRNP A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hnrnpa1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hnrnpa1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di hnRNP A1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hnrnpa1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da hnRNP A1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via hnRNP A1 nelle cellule tumorali con espressione di Hnrnpa1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.