HIF1a Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420856-ACT

Mouse Hif1a codifica il fattore inducibile dall’ipossia 1 alfa (HIF1a), un fattore di trascrizione sensibile all’ossigeno che integra le risposte cellulari alla ridotta tensione di ossigeno. Quando stabilizzato, HIF1a dimerizza con ARNT per attivare geni contenenti l’elemento di risposta all’ipossia, che regolano il metabolismo glicolitico, la segnalazione angiogenica, l’eritropoiesi, la funzione mitocondriale e la sopravvivenza cellulare, intersecandosi con gli input delle vie PI3K–AKT–mTOR e MAPK. HIF1a coordina inoltre programmi infiammatori e immunitari tramite crosstalk con NF-κB e le vie redox, modulando la polarizzazione mieloide e l’adattamento delle barriere. La deregolazione della segnalazione di HIF1a è ampiamente impiegata come nodo meccanicistico in studi su ischemia, infiammazione cronica, fibrosi, malattie metaboliche e biologia dell’ipossia tumorale in sistemi di modelli murini.

HIF1a Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hif1a senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HIF1a Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hif1a nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hif1a, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HIF1a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hif1a nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HIF1a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HIF1a nelle cellule tumorali con espressione di Hif1a silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.