HECTD3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406532-ACT

HECTD3 codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina con dominio HECT che regola la stabilità proteica e l’output di segnalazione attraverso modificazioni ubiquitina-dipendenti dei componenti delle vie di segnale. Modellando le dinamiche di ubiquitinazione, HECTD3 influenza processi cellulari quali la segnalazione dell’immunità innata, i programmi trascrizionali infiammatori e le vie di risposta allo stress che convergono su NF-κB e su reti associate agli interferoni. Un’attività alterata della ligasi dell’ubiquitina e il conseguente riassetto della segnalazione a valle sono frequentemente implicati in disfunzioni immunitarie e fenotipi oncogeni, rendendo HECTD3 un nodo utile per studi meccanicistici di trasduzione del segnale e proteostasi. I ricercatori analizzano comunemente HECTD3 per capire come le ligasi E3 modulino ampiezza, durata e crosstalk delle vie di segnalazione nelle cellule umane.

HECTD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HECTD3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HECTD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HECTD3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HECTD3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HECTD3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HECTD3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HECTD3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HECTD3 nelle cellule tumorali con espressione di HECTD3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.