Plasmide CRISPR d'Activation (h) GTPBP9: sc-405643-ACT

L’OLA1 humain code la protéine Obg-like ATPase 1, également appelée GTPBP9, une NTPase de type P-loop impliquée dans la régulation de l’homéostasie protéique et des réponses cellulaires au stress. OLA1/GTPBP9 a été associée à la modulation de processus liés à la traduction et au contrôle qualité dépendant des chaperonnes, contribuant à façonner la protéostasie dans des conditions de stress oxydatif et métabolique. Par ces activités, elle peut influencer des réseaux de signalisation qui couplent l’état nutritionnel à la synthèse et au repliement des protéines, notamment des voies recoupant les réponses intégrées au stress. Une expression dérégulée d’OLA1/GTPBP9 a été rapportée dans de multiples contextes pathologiques, ce qui en fait une cible de recherche pertinente pour étudier les phénotypes d’adaptation au stress, la prolifération et le maintien du protéome dans les cellules humaines.

GTPBP9 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de OLA1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GTPBP9 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus OLA1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription OLA1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GTPBP9. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus OLA1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GTPBP9 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GTPBP9 dans les cellules tumorales présentant une expression de OLA1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.