GRK 4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402816-ACT

A GRK4 (quinase de receptor acoplado à proteína G 4) humana é uma quinase de serina/treonina que fosforila GPCRs ativados, promovendo a dessensibilização e a internalização do receptor por mecanismos dependentes de β-arrestina. Ela é amplamente estudada em contextos de sinalização dopaminérgica e renal, nos quais pode modular a responsividade de receptores e vias de segundos mensageiros a jusante, como cAMP/PKA. A atividade da GRK4 influencia o término do sinal celular, o tráfego de receptores e a reprogramação adaptativa da sinalização, que molda a homeostase dos receptores de membrana. Variações genéticas e alterações na expressão de GRK4 têm sido investigadas em relação a fenótipos cardiometabólicos e renais, sustentando sua relevância para estudos mecanísticos da biologia de doenças impulsionadas por GPCRs.

GRK 4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GRK4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GRK 4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GRK4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GRK4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GRK 4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GRK4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GRK 4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GRK 4 em células tumorais com expressão de GRK4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.