GPR4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-435597-ACT

O gene murino Gpr4 codifica o GPR4, um receptor acoplado à proteína G (GPCR) sensor de prótons que detecta a acidificação extracelular e se acopla às vias de sinalização de cAMP/PKA e associadas a Rho para regular programas transcricionais. A atividade do GPR4 influencia o comportamento de células endoteliais e imunes, incluindo a função de barreira, o tráfego de leucócitos e respostas mediadas por citocinas a mudanças no pH tecidual. Ao integrar o sensoriamento de pH com redes de sinalização de GPCRs, o GPR4 contribui para a regulação homeostática em microambientes hipóxicos ou sob estresse metabólico. A desregulação da sinalização do GPR4 tem sido associada a disfunção vascular ligada à inflamação e a respostas de estresse dependentes de pH, tornando-o relevante para estudos mecanísticos de sensoriamento do microambiente.

GPR4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Gpr4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPR4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Gpr4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Gpr4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPR4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Gpr4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPR4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPR4 em células tumorais com expressão de Gpr4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.