GPAA1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-411203-ACT

GPAA1 (glycosylphosphatidylinositol anchor attachment 1) codifica uma subunidade central do complexo transamidase de GPI no retículo endoplasmático, que catalisa a ligação de âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI) a proteínas recém-sintetizadas. Essa etapa de processamento permite a ancoragem adequada à membrana e o tráfego de muitas proteínas de superfície celular envolvidas em sinalização, adesão e modulação imune, vinculando o GPAA1 ao controle de qualidade de proteínas no RE e à homeostase da via secretória. Alterações na biogênese de âncoras de GPI podem desorganizar a composição do proteoma de superfície e vias a jusante, como a sinalização mediada por receptores e as interações célula–célula. O GPAA1 e genes relacionados da via de âncora de GPI são estudados no contexto de distúrbios congênitos da glicosilação, fenótipos do neurodesenvolvimento e respostas ao estresse celular associadas ao processamento comprometido no RE.

GPAA1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GPAA1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPAA1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GPAA1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GPAA1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPAA1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GPAA1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPAA1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPAA1 em células tumorais com expressão de GPAA1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.