Glyoxalase I Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401914-ACT

O GLO1 humano codifica a glicoxalase I, uma metaloenzima dependente de zinco que catalisa a primeira etapa — e a etapa limitante da velocidade — do sistema da glicoxalase, convertendo o subproduto glicolítico citotóxico metilglioxal (na forma de hemithioacetal com glutationa) em S‑D‑lactoilglutationa. Ao controlar os níveis de metilglioxal, o GLO1 ajuda a limitar a glicação não enzimática de proteínas e ácidos nucleicos e reduz a formação de produtos finais de glicação avançada, influenciando assim a homeostase redox e as respostas celulares ao estresse. A atividade do GLO1 está ligada à reprogramação metabólica e à capacidade de desintoxicação, processos frequentemente investigados em modelos de estresse oxidativo, inflamação e metabolismo da glicose alterado. A depuração desregulada de metilglioxal e o aumento da carga de glicação são relevantes para fenótipos associados a doenças, incluindo resistência à insulina, disfunção vascular e tolerância de células tumorais ao estresse, sustentando o uso do GLO1 como um nó funcional em pesquisas de metabolismo e proteostase.

Glyoxalase I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GLO1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Glyoxalase I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GLO1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GLO1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Glyoxalase I. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GLO1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Glyoxalase I no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Glyoxalase I em células tumorais com expressão de GLO1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.