GFAT1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403022-ACT

O GFPT1 humano codifica a glutamina—frutose-6-fosfato amidotransferase 1 (GFAT1), a enzima limitante de velocidade da via biossintética das hexosaminas, que converte frutose-6-fosfato e glutamina em glicosamina-6-fosfato, controlando assim os níveis celulares de UDP-GlcNAc. Ao regular a disponibilidade de substrato para glicosilação ligada a N e a O, a GFAT1 influencia a proteostase, o tráfego de membranas e programas de sinalização responsivos ao estado nutricional. A atividade de GFPT1 conecta o metabolismo de glicose e aminoácidos a vias adaptativas ao estresse, incluindo a homeostase do RE e o equilíbrio redox, e modula dinâmicas transcricionais e do citoesqueleto dependentes de O-GlcNAcilação. Alterações na função de GFPT1 têm sido associadas a síndromes miastênicas congênitas e foram estudadas no contexto do remodelamento metabólico e de mudanças de glicosilação observadas em diversos estados celulares relevantes para doenças.

GFAT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GFPT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GFAT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GFPT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GFPT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GFAT1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GFPT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GFAT1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GFAT1 em células tumorais com expressão de GFPT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.