Gephyrin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401197-ACT

Il gene umano **GPHN** codifica la **gefirina**, una proteina impalcatura multifunzionale che ancora i recettori dei neurotrasmettitori inibitori alle membrane postsinaptiche e organizza nanodomini di segnalazione critici per la trasmissione sinaptica. La gefirina lega e stabilizza i recettori **GABA\_A** e della **glicina** e interagisce con componenti del citoscheletro e del traffico intracellulare per regolare il clustering dei recettori, la maturazione delle sinapsi e la plasticità. Oltre al ruolo sinaptico, la gefirina partecipa alla biosintesi del **cofattore del molibdeno**, collegandola all’attività di enzimi redox essenziali e all’omeostasi metabolica cellulare. La disregolazione dell’espressione di **GPHN** o dell’organizzazione dei recettori dipendente dalla gefirina è stata associata, in studi meccanicistici, ad alterazioni della funzione dei circuiti inibitori ed è rilevante per fenotipi neuroevolutivi e correlati alle crisi epilettiche.

Gephyrin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPHN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gephyrin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPHN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPHN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gephyrin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPHN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gephyrin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gephyrin nelle cellule tumorali con espressione di GPHN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.