GARNL1 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-403936-ACT

ヒトのRALGAPA1は、Ral GTPアーゼ活性化タンパク質（GAP）複合体のサブユニットであるGARNL1をコードしており、Rasファミリーからの入力の下流におけるRalAおよびRalBシグナル伝達の主要な負の制御因子です。GARNL1はRalタンパク質のGTP加水分解を促進することで、小胞輸送、エキソサイトーシス、細胞骨格の再編成、ならびに細胞増殖や遊走に影響する細胞周期関連のシグナル制御点などの過程を適切に調整します。Ral経路活性の破綻は、がん化シグナル伝達ネットワークや膜動態の変化にしばしば関与するため、RALGAPA1/GARNL1はRas–Ral軸の調節機構を解析するうえで有用な足掛かりとなります。この制御モジュールの撹乱は、MAPKおよびPI3Kシグナルとの経路クロストークや、状況依存的な細胞接着・極性の変化を研究するうえでも重要です。

GARNL1 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性RALGAPA1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

GARNL1 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における RALGAPA1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はRALGAPA1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性GARNL1の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のRALGAPA1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるGARNL1依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびRALGAPA1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるGARNL1経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。