GALE Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-408127-ACT

A GALE (UDP-galactose-4-epimerase) humana catalisa a interconversão reversível entre UDP-galactose e UDP-glicose, bem como entre UDP-N-acetilgalactosamina e UDP-N-acetilglicosamina, conectando a via de Leloir a um metabolismo mais amplo de açúcares nucleotídicos. Por meio dessas atividades, a GALE ajuda a manter a homeostase dos carboidratos e fornece açúcares ativados necessários para processos de glicosilação que moldam o dobramento e o tráfego de proteínas, além da sinalização célula–célula. A disrupção do fluxo dependente de GALE pode alterar a composição de glicanos e afetar programas biossintéticos associados ao RE e ao complexo de Golgi. A disfunção de GALE está associada à galactosemia por deficiência de epimerase e é relevante para estudos de respostas ao estresse metabólico e de fenótipos ligados à glicosilação.

GALE O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GALE sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GALE O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GALE em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GALE, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GALE. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GALE nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GALE no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GALE em células tumorais com expressão de GALE silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.