G9a Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-430994-ACT

O Ehmt2 de camundongo codifica a metiltransferase de lisina G9a, um dos principais “writers” de mono- e dimetilação de H3K9, que estabelece cromatina repressiva e estabiliza programas transcricionais específicos de linhagem. A G9a coopera com outros reguladores epigenéticos para controlar a formação de heterocromatina, a comunicação cruzada com a metilação do DNA e o silenciamento transcricional ao longo do desenvolvimento, da regulação imune e da diferenciação neuronal. Por meio desses mecanismos baseados em cromatina, o Ehmt2 influencia a progressão do ciclo celular, a estabilidade do genoma e redes de expressão gênica responsivas ao estresse. A atividade desregulada de G9a e padrões alterados de metilação de H3K9 são frequentemente explorados em modelos de doença de câncer, transtornos do neurodesenvolvimento e patologias inflamatórias para investigar fatores epigenéticos que impulsionam a expressão gênica aberrante.

G9a O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ehmt2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

G9a O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ehmt2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ehmt2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de G9a. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ehmt2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de G9a no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via G9a em células tumorais com expressão de Ehmt2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.