G3BP1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424175-ACT

Il G3BP1 murino (G3bp1) è una proteina legante l’RNA che agisce come nucleatore centrale dei granuli di stress e come coordinatore dello smistamento dell’mRNA durante lo stress cellulare. Integra segnali provenienti da vie quali il controllo della traduzione dipendente da eIF2α e interagisce con le risposte dell’immunità innata e antivirali attraverso la regolazione del metabolismo dell’RNA e dell’assemblaggio di ribonucleoproteine. G3BP1 influenza la sopravvivenza cellulare, la proliferazione e l’apoptosi modulando la stabilità e la traduzione di trascritti coinvolti in programmi di crescita e infiammatori. Un’attività deregolata di G3BP1 e alterazioni nella dinamica dei granuli di stress sono state collegate a neurodegenerazione, patogenesi virale e cambiamenti associati al cancro nella regolazione post-trascrizionale, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici di biologia dell’RNA.

G3BP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di G3bp1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

G3BP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus G3bp1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione G3bp1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di G3BP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus G3bp1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da G3BP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via G3BP1 nelle cellule tumorali con espressione di G3bp1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.