Plasmide CRISPR d'Activation (h) Fumarylacetoacetase: sc-402478-ACT

FAH code la fumarylacétoacétase humaine, une enzyme cytosolique qui catalyse l’étape terminale du catabolisme de la tyrosine en hydrolysant le fumarylacétoacétate en fumarate et en acétoacétate. Cette réaction relie la dégradation des acides aminés aromatiques au métabolisme central du carbone via la production de précurseurs du cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et des corps cétoniques, et contribue à empêcher l’accumulation d’intermédiaires réactifs capables de modifier les macromolécules cellulaires. Une altération de l’activité de FAH est associée à la tyrosinémie héréditaire de type I et est largement utilisée comme modèle de stress métabolique des hépatocytes, de réponses aux dommages de l’ADN et de systèmes de sélection spécifiques du foie en contexte expérimental. Ainsi, FAH constitue un nœud clé pour l’étude des flux des voies métaboliques, de la capacité de détoxification et de l’homéostasie des hépatocytes.

Fumarylacetoacetase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FAH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Fumarylacetoacetase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FAH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FAH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Fumarylacetoacetase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FAH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Fumarylacetoacetase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Fumarylacetoacetase dans les cellules tumorales présentant une expression de FAH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.