fumarate hydratase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401660-ACT

O FH humano codifica a fumarato-hidratase (fumarase), uma enzima homotetramérica do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) que catalisa a hidratação reversível do fumarato em L-malato, conectando o metabolismo energético mitocondrial à anaplerose e à homeostase redox. Além do fluxo central de carbono, os níveis de fumarato influenciam a sinalização celular por meio da succinação de proteínas e da modulação de programas epigenéticos e associados à hipóxia, ligando a atividade de FH às respostas ao estresse mitocondrial e à reprogramação metabólica. A perturbação da função de FH tem sido associada ao metabolismo oncogênico e a alterações no manejo de espécies reativas de oxigênio, tornando FH um nó-chave para estudar disfunção mitocondrial, checkpoints metabólicos e relações entre genoma e metabólitos em células humanas.

fumarate hydratase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

fumarate hydratase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de fumarate hydratase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de fumarate hydratase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via fumarate hydratase em células tumorais com expressão de FH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.