Plasmide CRISPR d'Activation (h) FAT2: sc-402931-ACT

FAT2 humain code une protéine atypique de type cadhérine appartenant à la famille FAT, impliquée dans l’adhésion cellule–cellule, la polarité planaire et la régulation de l’organisation du cytosquelette. La signalisation associée à FAT2 s’articule avec des processus qui façonnent l’architecture épithéliale, la migration directionnelle et la morphogenèse tissulaire, la reliant ainsi à des voies qui gouvernent l’établissement de la polarité et l’intégrité des jonctions. Des altérations de l’activité des protéines de la famille FAT ont été associées à une dérégulation du contrôle de la croissance et à des phénotypes invasifs dans de multiples contextes pathologiques, ce qui motive l’étude de FAT2 en mécano-biologie et dans l’homéostasie épithéliale. FAT2 est donc pertinente pour des travaux sur la signalisation dépendante de la polarité, l’organisation membranaire et les programmes transcriptionnels liés à l’adhésion.

FAT2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FAT2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FAT2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FAT2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FAT2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FAT2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FAT2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FAT2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FAT2 dans les cellules tumorales présentant une expression de FAT2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.