Plásmido CRISPR de Activación (h) FANCM: sc-403495-ACT

El FANCM humano codifica una translocasa de ADN que funciona en la vía de la anemia de Fanconi (FA) para mantener la estabilidad del genoma durante el estrés de replicación del ADN. FANCM reconoce horquillas de replicación detenidas y entrecruzamientos intercatenarios, y coordina con el complejo central de la FA, la señalización del punto de control dependiente de ATR y factores de recombinación homóloga para promover la remodelación y la reparación de la horquilla. A través de sus funciones en el paso de la horquilla de replicación, el reinicio y la supresión de recombinación aberrante, FANCM ayuda a limitar la rotura cromosómica y la mutagénesis. La alteración de la reparación mediada por FANCM se asocia con una capacidad reducida de reparar entrecruzamientos y con fenotipos de inestabilidad genómica relevantes para la biología de la anemia de Fanconi y para alteraciones de la respuesta al daño del ADN asociadas al cáncer.

FANCM El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FANCM sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

FANCM El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FANCM en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FANCM, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de FANCM. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FANCM y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de FANCM en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía FANCM en células tumorales con expresión de FANCM silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.