FANCM Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403495-ACT

O FANCM humano codifica uma translocase de DNA que atua na via da anemia de Fanconi (FA) para manter a estabilidade do genoma durante o estresse de replicação do DNA. O FANCM reconhece forquilhas de replicação estagnadas e ligações cruzadas intercadeias, coordenando-se com o complexo central da FA, a sinalização de checkpoint dependente de ATR e fatores de recombinação homóloga para promover o remodelamento e o reparo da forquilha. Por meio de seus papéis na travessia da forquilha de replicação, no reinício da replicação e na supressão de recombinação aberrante, o FANCM ajuda a limitar quebras cromossômicas e mutagênese. A disrupção do reparo mediado por FANCM está associada à capacidade reduzida de reparar ligações cruzadas e a fenótipos de instabilidade genômica relevantes para a biologia da anemia de Fanconi e para alterações da resposta a dano no DNA associadas ao câncer.

FANCM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FANCM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FANCM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FANCM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FANCM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FANCM. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FANCM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FANCM no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FANCM em células tumorais com expressão de FANCM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.