Factor VIII Double Nickaseプラスミド (h): sc-400373-NIC

ヒトF8は凝固第VIII因子をコードしており、これは糖タンパク質性の補因子で、血中ではフォン・ヴィレブランド因子（vWF）に結合して循環し、内因系経路においてトロンビンにより活性化されます。活性化第VIII因子（FVIIIa）はリン脂質表面上で第IXa因子とともに内因系テンナーゼ複合体を形成し、第X因子の活性化および凝固カスケードにおける下流のトロンビン産生を加速します。F8の機能喪失型バリアントは内因系経路の効率を低下させ、血友病Aと強く関連することから、止血、内皮—肝臓におけるタンパク質生合成、ならびにプロテアーゼ補因子の制御を研究するための分子学的な入り口となります。F8を実験的に改変することで、凝固ネットワーク動態、FVIIIのプロセシングと分泌、そしてヒト細胞モデルにおけるvWFとの相互作用の機序解析が可能になります。

Factor VIII ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における F8 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、F8内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、F8の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、F8が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。