EXOSC3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403842-ACT

O EXOSC3 humano codifica uma subunidade central de “cap” do exossoma de RNA, um complexo essencial multiproteico que realiza processamento e degradação exonucleolítica de RNA no sentido 3′→5′, tanto no núcleo quanto no citoplasma. O EXOSC3 sustenta vias de controle de qualidade de RNA que regulam a maturação de rRNA, sn/snoRNA e a renovação (turnover) de diversos RNAs não codificantes e RNAs mensageiros, influenciando assim a biogênese de ribossomos e a vigilância de RNA. A perturbação da integridade do exossoma pode alterar a homeostase do transcriptoma e as respostas ao estresse, vinculando a biologia do EXOSC3 a mecanismos subjacentes a fenótipos do neurodesenvolvimento e neurodegenerativos. Como componente conservado do exossoma, o EXOSC3 é frequentemente estudado para compreender como o metabolismo de RNA molda a diferenciação celular e a proteostase.

EXOSC3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EXOSC3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EXOSC3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EXOSC3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EXOSC3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EXOSC3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EXOSC3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EXOSC3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EXOSC3 em células tumorais com expressão de EXOSC3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.