Ero1-Lα Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401747-ACT

O ERO1A humano codifica a Ero1-Lα, uma oxidorredutase do retículo endoplasmático (RE) que impulsiona o dobramento oxidativo de proteínas ao reoxidar a isomerase de dissulfeto de proteína (PDI) e promover a formação de pontes dissulfeto. Ao se acoplar à rede redox do RE, a Ero1-Lα influencia a homeostase do RE, a capacidade de fluxo da via secretora e a resposta a proteínas mal dobradas (UPR) em condições de estresse proteostático. Sua atividade contribui para a sinalização redox por meio da produção regulada de espécies reativas de oxigênio e se cruza com vias que controlam a adaptação à hipóxia e o metabolismo celular. Alterações na expressão de ERO1A têm sido associadas à biologia tumoral, a respostas inflamatórias ao estresse e a doenças caracterizadas por estresse do RE e mau dobramento proteico.

Ero1-Lα O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ERO1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ero1-Lα O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ERO1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ERO1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ero1-Lα. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ERO1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ero1-Lα no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ero1-Lα em células tumorais com expressão de ERO1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.