Emi2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405054-ACT

FBXO43 codifica a proteína humana Emi2, um regulador que contém um domínio F-box, mais conhecido por controlar transições do ciclo celular por meio da modulação da atividade do APC/C e da consequente degradação de reguladores mitóticos. Ao restringir a função do complexo promotor de anáfase até que os sinais apropriados do ciclo celular sejam atendidos, a Emi2 contribui para a progressão coordenada pela fase M e para a manutenção da integridade genômica. Alterações na expressão ou na regulação de vias do sistema ubiquitina–proteassoma associadas a proteínas F-box são frequentemente ligadas a fenótipos proliferativos e à instabilidade cromossômica observada na biologia do câncer. Assim, FBXO43/Emi2 serve como um ponto de entrada mecanístico para estudar a proteólise mediada por ubiquitina, o controle de checkpoints e a proliferação desregulada em modelos celulares humanos.

Emi2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FBXO43 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Emi2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FBXO43 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FBXO43, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Emi2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FBXO43 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Emi2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Emi2 em células tumorais com expressão de FBXO43 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.