ECH1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406076-ACT

A ECH1 (enoil-CoA hidratase 1) é uma enzima mitocondrial que catalisa uma etapa de hidratação na β-oxidação de ácidos graxos e participa do catabolismo de intermediários acil-CoA de cadeia ramificada e insaturados. Ao sustentar a utilização mitocondrial de lipídios e o suprimento de acetil-CoA, a ECH1 contribui para a homeostase energética celular e se conecta a programas metabólicos mais amplos que se cruzam com o equilíbrio redox e a função mitocondrial. Alterações na oxidação de ácidos graxos e a reprogramação metabólica mitocondrial são características recorrentes de distúrbios metabólicos e da biologia do câncer, tornando a ECH1 um ponto útil para estudar como o fluxo de lipídios influencia o crescimento celular, a adaptação ao estresse e a sinalização metabólica. A ECH1 também é relevante para investigar a comunicação entre peroxissomos e mitocôndrias e o manejo de intermediários de ácidos graxos potencialmente tóxicos.

ECH1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ECH1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ECH1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ECH1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ECH1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ECH1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ECH1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ECH1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ECH1 em células tumorais com expressão de ECH1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.