DPYD Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403396-ACT

O DPYD humano codifica a di-hidropirimidina desidrogenase, uma flavoproteína citosólica que catalisa a etapa limitante da velocidade na redução de uracilo e timina, iniciando o catabolismo das pirimidinas. Ao controlar a renovação (turnover) de pirimidinas, o DPYD influencia a homeostase de nucleotídeos, o equilíbrio de precursores de RNA/DNA e as respostas celulares ao estresse metabólico. Alterações na atividade do DPYD têm sido associadas a erros inatos do metabolismo de pirimidinas e à variabilidade no processamento de fluoropirimidinas, conectando essa via a contextos de pesquisa em neurodesenvolvimento e farmacogenômica. Assim, o DPYD é um ponto útil para estudar regulação metabólica, bioquímica redox e efeitos em nível de via sobre proliferação e aptidão celular.

DPYD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DPYD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DPYD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DPYD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DPYD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DPYD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DPYD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DPYD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DPYD em células tumorais com expressão de DPYD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.