DNA pol ζ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402579-ACT

REV3L codifica a subunidade catalítica da DNA polimerase ζ (pol ζ), uma polimerase especializada de síntese por translesão que prolonga a partir de nucleótidos inseridos em frente a lesões no DNA, para sustentar a progressão da forquilha de replicação sob stress genotóxico. Em coordenação com REV7 (MAD2L2) e a sinalização por ubiquitina em forquilhas bloqueadas, a pol ζ atua em vias de tolerância a danos no DNA que fazem interface com respostas ao stress de replicação e com a reparação pós-replicação. Como a pol ζ é intrinsecamente propensa a erros, a atividade de REV3L influencia a carga mutacional e a estabilidade do genoma, ligando a sua regulação a processos como a carcinogénese e a resistência a exposições que danificam o DNA em sistemas modelo. A função alterada de REV3L também afeta a progressão do ciclo celular e a sinalização de checkpoints ao modular o desfecho entre o bypass de lesões e o colapso da forquilha.

DNA pol ζ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de REV3L sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA pol ζ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus REV3L em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição REV3L, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA pol ζ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus REV3L nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA pol ζ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA pol ζ em células tumorais com expressão de REV3L silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.