DNA pol ν Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406518-ACT

POLN codifica a polimerase de DNA ν (DNA pol ν), uma polimerase da família A implicada na tolerância a danos no DNA e na manutenção do genoma por meio da síntese de DNA por translesão e de etapas relacionadas de síntese de DNA associadas ao reparo. A atividade da DNA pol ν tem sido associada ao processamento de lesões que bloqueiam as polimerases replicativas, influenciando assim a progressão da forquilha de replicação e o equilíbrio entre resultados de reparo do DNA propensos a erro e livres de erro. Como parte de vias mais amplas de reparo do DNA e de resposta ao estresse replicativo, POLN contribui para a manutenção da estabilidade cromossômica sob estresse genotóxico. A expressão ou função desregulada de POLN tem sido associada a fenótipos de mutagênese e instabilidade genômica relevantes para estudos mecanísticos de defeitos de reparo do DNA associados ao câncer.

DNA pol ν O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POLN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA pol ν O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POLN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POLN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA pol ν. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POLN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA pol ν no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA pol ν em células tumorais com expressão de POLN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.