DNA-PK_CS Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422405-ACT

Prkdc codifica a subunidade catalítica da proteína quinase dependente de DNA, DNA-PKCS, um regulador central do reparo de quebras de dupla fita do DNA por junção de extremidades não homólogas (NHEJ). A DNA-PKCS forma um holoenzima ativo com o complexo Ku70/Ku80 para coordenar o reconhecimento das extremidades, a sinapse, o processamento das extremidades e a ligação, e interage com a sinalização de ATM/ATR para moldar as respostas de checkpoint após estresse genotóxico. Em células de camundongo, a atividade de Prkdc também é essencial para a recombinação V(D)J durante o desenvolvimento de linfócitos, vinculando essa quinase à estabilidade do genoma e à maturação do sistema imune. A perturbação de vias de reparo dependentes de DNA-PKCS é amplamente utilizada para modelar radiossensibilidade, instabilidade cromossômica e defeitos de reparo do DNA relevantes para a biologia do câncer e para pesquisas sobre imunodeficiências.

DNA-PKCS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Prkdc sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA-PKCS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Prkdc em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Prkdc, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA-PKCS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Prkdc nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA-PKCS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA-PKCS em células tumorais com expressão de Prkdc silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.