DLST Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409604-ACT

DLST (dihidrolipoamida S-succiniltransferase) codifica o componente central E2 do complexo mitocondrial 2-oxoglutarato desidrogenase, um nó enzimático-chave no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Ao catalisar a formação de succinil-CoA a partir de α-cetoglutarato e coordenar a transferência de acila dependente de lipoato, a DLST sustenta o metabolismo oxidativo, a produção de NADH e o equilíbrio redox mitocondrial. A função de DLST conecta o metabolismo central do carbono ao catabolismo de aminoácidos e a uma homeostase mitocondrial mais ampla, processos frequentemente estudados em contextos de estresse metabólico e disfunção mitocondrial. A regulação alterada de componentes do ciclo do TCA, incluindo a DLST, tem sido associada na literatura à remodelação bioenergética observada na biologia de doenças neurodegenerativas e proliferativas, reforçando sua relevância para pesquisas mecanísticas.

DLST O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DLST sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DLST O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DLST em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DLST, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DLST. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DLST nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DLST no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DLST em células tumorais com expressão de DLST silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.