DinB CRISPR Activationプラスミド (h): sc-405052-ACT

ヒトPOLKはDNAポリメラーゼκ（DinB）をコードしており、UV誘導性光産物やベンゾ[a]ピレン付加体のような嵩高い損傷をまたいでDNA複製を可能にする、Yファミリーの損傷乗り越え（トランスリージョン合成）ポリメラーゼである。S期における損傷耐性を促進することで、POLKは複製フォークの進行維持に寄与し、忠実度が低下した状態でバイパスが起こる際には変異スペクトルにも影響を与える。POLKは、損傷部位のバイパス、ポリメラーゼの切り替え、複製後修復を協調させるDNA損傷応答ネットワークの中で機能し、ゲノム安定性や細胞のストレス適応とも関連づけられている。POLK活性の異常な制御や発現変化は、発がん研究や曝露関連DNA損傷モデルにおける変異誘発およびゲノム不安定性と関連して報告されている。

DinB CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性POLKの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

DinB CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における POLK 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPOLK転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性DinBの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPOLK遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるDinB依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPOLK発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるDinB経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。