DEC-205 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-417220-ACT

LY75 codifica o DEC-205 (CD205), um recetor endocítico do tipo lectina C altamente expresso por subpopulações de células dendríticas e por células epiteliais tímicas, onde favorece a captação eficiente e o encaminhamento de ligandos extracelulares para compartimentos de processamento de antigénios. Por meio de endocitose mediada por recetor e do encaminhamento para vias de MHC de classe II e de apresentação cruzada, o DEC-205 ajuda a moldar a ativação inicial de células T, a tolerância periférica e a seleção tímica. A sua expressão e o seu tráfego celular intersectam-se com o transporte vesicular, o processamento dependente de lisossomas e a biologia da sinapse imunitária. A manipulação desregulada de antigénios e a distribuição alterada do DEC-205 têm sido estudadas no contexto de inflamação, autoimunidade e modulação imunitária associada a tumores, como biomarcadores do estado das células apresentadoras de antigénio.

DEC-205 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LY75 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DEC-205 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LY75 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LY75, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DEC-205. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LY75 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DEC-205 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DEC-205 em células tumorais com expressão de LY75 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.