DDX30 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-411632-ACT

DHX30 (DDX30) codifica uma helicase de RNA da família DEAD-box dependente de ATP que modula a estrutura secundária do RNA para dar suporte ao metabolismo de RNA, incluindo aspectos da regulação transcricional, do processamento de RNA e da tradução. Como helicase, a DDX30 contribui para a remodelação de ribonucleoproteínas e para processos de controle de qualidade do RNA que influenciam respostas celulares ao estresse e programas de expressão gênica mitocondriais e citosólicos. Alterações na atividade de helicases de RNA podem perturbar a proteostase e redes de sinalização da imunidade inata por meio de efeitos no reconhecimento de RNA e no destino dos transcritos. A desregulação de DHX30 tem sido associada a fenótipos de neurodesenvolvimento e a mudanças transcriptômicas mais amplas relevantes para doenças, tornando-o um alvo útil para estudar mecanismos centrados em RNA em células humanas.

DDX30 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DHX30 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DDX30 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DHX30 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DHX30, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DDX30. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DHX30 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DDX30 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DDX30 em células tumorais com expressão de DHX30 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.