Cystinosin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405040-ACT

CTNS codifica la cistinosina, un trasportatore di membrana lisosomiale che media l’efflusso di cistina dal lume del lisosoma al citosol, contribuendo al mantenimento dell’equilibrio redox intracellulare e dell’omeostasi degli amminoacidi. Regolando la rimozione della cistina dai lisosomi, la cistinosina collega la funzione lisosomiale a processi metabolici più ampi, inclusi la dinamica autofagia–lisosoma e le risposte allo stress cellulare. Un’alterata attività di CTNS compromette l’accumulo lisosomiale e le vie a valle della proteostasi, rendendolo un nodo chiave per lo studio del controllo di qualità degli organelli e dell’adattamento metabolico. CTNS è implicato nella disfunzione lisosomiale associata alla cistinosi ed è spesso analizzato in modelli della fisiologia del tubulo prossimale renale e del trasporto sistemico di amminoacidi.

Cystinosin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CTNS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cystinosin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CTNS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CTNS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cystinosin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CTNS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cystinosin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cystinosin nelle cellule tumorali con espressione di CTNS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.