CYP8B1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403383-ACT

O CYP8B1 humano codifica a 12α-hidroxilase de esteróis, uma enzima microssomal do citocromo P450 que determina a composição dos ácidos biliares ao catalisar uma etapa-chave de hidroxilação necessária para a síntese do ácido cólico. Por meio de seu papel na via clássica de biossíntese de ácidos biliares, o CYP8B1 influencia a razão entre ácido cólico e ácido quenodesoxicólico, modulando assim a renovação do colesterol hepático, a absorção intestinal de lipídios e a sinalização mediada por ácidos biliares. A atividade do CYP8B1 está funcionalmente ligada à homeostase metabólica por meio de interações com vias de receptores nucleares como o FXR e programas transcricionais relacionados que regulam o transporte de ácidos biliares e a retroalimentação. Alterações na expressão do CYP8B1 ou nos perfis de ácidos biliares têm sido associadas a dislipidemia, resistência à insulina, doença hepática gordurosa não alcoólica e fenótipos hepáticos colestáticos, tornando-o um ponto útil para estudos mecanísticos do metabolismo hepatobiliar.

CYP8B1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CYP8B1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CYP8B1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CYP8B1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CYP8B1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CYP8B1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CYP8B1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CYP8B1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CYP8B1 em células tumorais com expressão de CYP8B1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.