CRY2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403171-ACT

Humanes CRY2 kodiert Cryptochrom 2, ein blau lichtempfindliches Flavoprotein, das als zentraler Repressor innerhalb der zirkadianen transkriptionell‑translationalen Rückkopplungsschleife fungiert. CRY2 reguliert die von CLOCK:BMAL1 gesteuerte Genexpression, indem es mit PER-Proteinen interagiert und den ubiquitinabhängigen Proteinabbau moduliert; dadurch prägt es tägliche Rhythmen von Stoffwechsel, Zellzyklus‑Timing und Hormonsignalgebung. Über die Kopplung an Netzwerke posttranslationaler Modifikationen, einschließlich Phosphorylierung und durch E3‑Ligasen vermittelter Proteostase, beeinflusst CRY2 Transkriptionsprogramme in peripheren Geweben. Eine dysregulierte CRY2‑Aktivität oder ‑Expression wurde mit einer veränderten Schlaf‑Wach‑Regulation und zirkadianer Fehlanpassung in Verbindung gebracht, die mit metabolischen und neuropsychiatrischen Phänotypen einhergeht, was CRY2 zu einem nützlichen Knotenpunkt für pfadzentrische Studien macht.

CRY2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CRY2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CRY2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CRY2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CRY2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CRY2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CRY2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CRY2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CRY2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CRY2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.