Plásmido CRISPR de Activación (m) copine 8: sc-426239-ACT

El gen Cpne8 de ratón codifica la copina 8, una proteína de unión a fosfolípidos dependiente de calcio que contiene dominios C2 y un dominio A que favorece una asociación regulada con la membrana. Los miembros de la familia de las copinas están implicados en eventos de señalización desencadenados por calcio en la membrana plasmática y en compartimentos endomembranosos, influyendo en el tráfico vesicular, la remodelación de membranas y la dinámica de reclutamiento de proteínas. Al acoplar los flujos de Ca2+ con interacciones proteicas próximas a la membrana, la copina 8 es relevante para vías que moldean el recambio de receptores y la amplitud de la señalización intracelular. La regulación alterada de las redes de calcio y del tráfico de membranas se estudia con frecuencia en contextos como la comunicación neuronal, la señalización inmunitaria y las respuestas al estrés, lo que convierte a Cpne8 en un objetivo útil para la interrogación mecanística de vías.

copine 8 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Cpne8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

copine 8 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Cpne8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Cpne8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de copine 8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Cpne8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de copine 8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía copine 8 en células tumorales con expresión de Cpne8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.