CNPase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402463-ACT

O gene CNP humano codifica a 2′,3′-nucleotídeo cíclico 3′-fosfodiesterase (CNPase), uma enzima abundante associada à mielina, implicada na maturação de oligodendrócitos, na manutenção da bainha de mielina e na organização do citoesqueleto. A CNPase hidrolisa nucleotídeos cíclicos 2′,3′ e participa em processos associados ao RNA e em interações membrana–citoesqueleto que influenciam o crescimento de prolongamentos gliais e o acoplamento axónio–glia. Alterações na expressão ou na atividade de CNP têm sido associadas a fenótipos de desmielinização e a contextos neuroinflamatórios, tornando-a relevante para estudos da integridade da substância branca e da conectividade neural. Como marcador enriquecido em glia, a CNPase é frequentemente utilizada para investigar vias que regulam a mielinização, respostas ao stress em oligodendrócitos e mecanismos subjacentes à instabilidade da mielina.

CNPase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CNP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CNPase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CNP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CNP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CNPase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CNP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CNPase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CNPase em células tumorais com expressão de CNP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.