CNOT1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403431-ACT

O CNOT1 humano codifica um andaime central do complexo CCR4–NOT, um regulador multissubunidade da expressão gênica que acopla o controle transcricional à deadenilação, remoção do “cap” (decapping) e degradação do mRNA. Ao coordenar o recrutamento e a atividade de deadenilases e ao interagir com proteínas ligantes de RNA e com a maquinaria efetora de microRNAs, o CNOT1 ajuda a determinar a estabilidade dos transcritos e a eficiência de tradução em diversos programas celulares. Essa regulação é fundamental para a progressão do ciclo celular, a diferenciação, as respostas ao estresse e a manutenção da proteostase, por meio de efeitos amplos sobre a rotatividade de mRNAs. A desregulação de componentes do CCR4–NOT, incluindo o CNOT1, tem sido associada a alterações na homeostase de RNA e em programas transcricionais observados na biologia do câncer e em fenótipos do neurodesenvolvimento, reforçando sua relevância em estudos mecanísticos de redes regulatórias de genes ligadas a doenças.

CNOT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CNOT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CNOT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CNOT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CNOT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CNOT1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CNOT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CNOT1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CNOT1 em células tumorais com expressão de CNOT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.