CFTR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400653-ACT

CFTR codifica il regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica, un canale anionico regolato da cAMP/PKA che trasporta cloruro e bicarbonato attraverso le membrane epiteliali per controllare l’idratazione della superficie delle vie aeree, le proprietà del muco e il pH del lume. L’attività di CFTR si integra con reti di trasporto ionico che coinvolgono ENaC, gli scambiatori SLC26 e i macchinari di traffico di membrana per coordinare la secrezione di fluidi epiteliali e la clearance mucociliare. Un’espressione o una funzione di CFTR disregolata altera l’omeostasi epiteliale e le difese innate, contribuendo alla fibrosi cistica e a disturbi correlati che interessano polmone, pancreas, intestino e tessuti riproduttivi. CFTR è quindi ampiamente studiato nella segnalazione epiteliale, nella proteostasi e nel traffico di membrana, nonché in modelli di organoidi o di epitelio delle vie aeree per lo studio del trasporto ionico.

CFTR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CFTR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CFTR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CFTR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CFTR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CFTR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CFTR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CFTR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CFTR nelle cellule tumorali con espressione di CFTR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.