Centrin-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404287-ACT

Das menschliche CETN1 kodiert Centrin-1, ein konserviertes EF-Hand-Calciumbindungsprotein, das mit Zentrosomen und Basalkörperchen assoziiert und so die Zentriolenbiogenese, die Duplikation des Zentrosoms und die Organisation von Mikrotubuli unterstützt. Über Interaktionen mit zentrosomalen Gerüstproteinen und calciumabhängige Konformationsänderungen trägt Centrin-1 zum Fortschreiten des Zellzyklus und zur Genauigkeit des Aufbaus der mitotischen Spindel bei. Eine dysregulierte Zentriolenzahl und eine gestörte Zentrosomenfunktion sind mit chromosomaler Instabilität und veränderter Ziliogenese verknüpft, wodurch CETN1 für Studien zur Genomstabilität und proliferativen Signalgebung relevant ist. CETN1 wird außerdem häufig im Kontext gewebespezifischer Expressionsprogramme sowie aberranter Expressionsmuster untersucht, wie sie in der Krebsbiologie und der Entwicklungsregulation beobachtet werden.

Centrin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CETN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Centrin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CETN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CETN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Centrin-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CETN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Centrin-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Centrin-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CETN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.