CENP-F Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402178-ACT

CENPF codifica a CENP-F, uma grande proteína em hélice-enrolada (coiled-coil) associada ao cinetócoro, que se acumula ao longo de S/G2 e atinge o pico na mitose, coordenando o alinhamento dos cromossomos, a sinalização do checkpoint do fuso e a segregação fiel. A CENP-F participa da ligação cinetócoro–microtúbulo, da função do centrossomo e da progressão pela transição G2/M, conectando o controle do ciclo celular à arquitetura nuclear. A desregulação da expressão de CENPF tem sido associada à instabilidade cromossômica e a fenótipos proliferativos descritos em múltiplos tipos de câncer, em consonância com seu papel na fidelidade mitótica. Como um efetor estrutural regulado pelo ciclo celular, a CENP-F é frequentemente estudada em vias que governam a mitose, a manutenção do genoma e a aneuploidia.

CENP-F O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CENPF sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CENP-F O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CENPF em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CENPF, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CENP-F. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CENPF nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CENP-F no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CENP-F em células tumorais com expressão de CENPF silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.