CDKN1B/Kip1 p27 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400074-ACT

CDKN1B codifica p27^Kip1, un inibitore delle chinasi ciclina-dipendenti che frena la progressione attraverso il checkpoint G1/S guidata da CDK2 e CDK4/6, modulando i complessi ciclina E/A–CDK2 e ciclina D–CDK4/6. p27 integra segnali mitogenici e antiproliferativi a valle di vie quali PI3K–AKT e TGF-β, e la sua abbondanza è strettamente controllata tramite ubiquitinazione dipendente dalla fosforilazione e degradazione proteasomiale. Attraverso questi meccanismi, CDKN1B influenza programmi di proliferazione, quiescenza e differenziamento in diversi tipi cellulari. Un’alterata espressione di CDKN1B o la sua mislocalizzazione sono frequentemente associate a un controllo deregolato del ciclo cellulare nella biologia dei tumori e a perturbazioni in contesti endocrini e dello sviluppo.

CDKN1B/Kip1 p27 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDKN1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CDKN1B/Kip1 p27 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDKN1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDKN1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CDKN1B/Kip1 p27. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDKN1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CDKN1B/Kip1 p27 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CDKN1B/Kip1 p27 nelle cellule tumorali con espressione di CDKN1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.